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    磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔單克隆抗體產品信息

    更新時間:2024-03-11      點擊次數:41


    反應性HMR Hm Mk Pg

    靈敏度內源性

    分子量(kDa)65

    來源/同種型兔免疫球蛋白G

    產品使用信息

    應用稀釋

    蛋白質印跡法1:1000

    Simple Western™1:10 - 1:50

    免疫沉淀1:50

    免疫熒光(免疫細胞化學)1:800 - 1:3200

    流式細胞儀(固定/透化)1:800 - 1:3200

    貯存 含有 10 mM HEPES 鈉 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 疊氮化na。儲存于 –20°C。不要等分抗體。

    蛋白質印跡實驗方案 對于蛋白質印跡,將膜與稀釋的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育過夜,并輕輕搖動。  注意:請參閱一抗產品網頁了解推薦的抗體稀釋度。

    A. 溶液和試劑 從樣品制備到檢測,您的蛋白質印跡所需的試劑現在都在一個方便的套件中:#12957蛋白質印跡應用解決方案套件  注:用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水制備溶液。  

    20X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS):( #9808 ) 要制備 1 L 1X PBS:將 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中,混合。

    10X Tris 緩沖鹽水 (TBS):( #12498 ) 要制備 1 L 1X TBS:將 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

    1X SDS 樣品緩沖液:藍色上樣包 ( #7722 ) 或紅色上樣包 ( #7723 ) 通過將 1/10 體積的 30X DTT 添加到 1 體積的 3X SDS 上樣緩沖液中來制備新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH 2 O稀釋至 1X。

    10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液:( #4050 ) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液:將 100 ml 10X 電泳緩沖液添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

    10X Tris-甘氨酸轉移緩沖液:( #12539 ) 要制備 1 L 1X 轉移緩沖液:將 100 ml 10X 轉移緩沖液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中,混合。

    10X Tris 緩沖鹽水與 Tween ® 20 (TBST):( #9997 ) 要制備 1 L 1X TBST:將 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中,混合。

    脫脂奶粉:(#9999)。

    封閉緩沖液:1X TBST,含 5% w/v 脫脂奶粉;對于 150 毫升,將 7.5 克脫脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

    洗滌緩沖液:( #9997 ) 1X TBST。

    牛血清白蛋白 (BSA):( #9998 )。

    一抗稀釋緩沖液:1X TBST,含 5% BSA;對于 20 ml,將 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

    生物素化蛋白梯檢測包:( #7727 )。

    藍色預染蛋白質標記物,寬范圍 (11-250 kDa):( #59329 )。

    印跡膜和紙:( #12369 ) 該方案已針對硝酸纖維素膜進行了優化。通常建議孔徑為 0.2 µm。

    與 HRP 綴合的二抗:抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 )。

    檢測試劑:SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。


    B. 蛋白質印跡 樣品制備的通用方案。

    通過添加含有調節劑的新鮮培養基來處理細胞所需的時間。

    從文化中吸取介質;用 1X PBS 清洗細胞;吸出。

    添加 1X SDS 樣品緩沖液(6 孔板每孔 100 µl,10 cm 直徑板每孔 500 µl)裂解細胞。立即從板上刮下細胞并將提取物轉移至微量離心管中。保持在冰上。

    超聲處理 10–15 秒以完成細胞裂解并剪切 DNA(以降低樣品粘度)。

    將 20 µl 樣品加熱至 95–100°C 5 分鐘;在冰上冷卻。

    微量離心 5 分鐘。

    將 20 µl 上樣到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。  

    注:建議加載預染色分子量標記(#59329,10 µl/泳道)以驗證

    電轉移和生物素化蛋白質梯(#7727,10 µl/泳道)以確定分子量。  

    電轉移至硝酸纖維素膜 ( #12369 )。


    C. 膜封閉和抗體孵育

    注:體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜;對于不同尺寸的膜,相應地調整體積。  

    I. 膜封閉

    (可選)轉膜后,用 25 ml TBS 室溫清洗硝酸纖維素膜 5 分鐘。

    將膜在 25 ml 封閉緩沖液中室溫孵育 1 小時。

    用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。

    二.一抗孵育

    將膜和一抗(按照產品網頁中推薦的適當稀釋度和稀釋劑)在 10 ml 一抗稀釋緩沖液中孵育,并在 4°C 下輕輕攪拌過夜。

    用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。

    將膜與抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 連接抗體 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育,以檢測 10 ml 溶液中的生物素化蛋白質標記物室溫下輕輕攪拌封閉緩沖液 1 小時。

    用 15 ml TBST 洗滌 3 次,每次 5 分鐘。 繼續檢測(D 部分)。


    D. 蛋白質檢測

    使用指南:

    在 TBST 中洗滌膜結合的 HRP(抗體偶聯物) 3 次,每次 5 分鐘。

    通過稀釋一份 2X 試劑 A 和一份 2X 試劑 B(例如,對于 10 ml,添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B)來制備 1X SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。攪拌均勻。

    將基質與膜一起孵育 1 分鐘,除去多余的溶液(膜保持濕潤),用塑料包裹并暴露于 X 射線膠片。


    * 避免反復接觸皮膚。


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