• <td id="iegeg"><option id="iegeg"></option></td>
  • <table id="iegeg"><option id="iegeg"></option></table>
  • <option id="iegeg"><noscript id="iegeg"></noscript></option>
    <td id="iegeg"><option id="iegeg"></option></td>
    您好!歡迎訪問上海牧榮生物科技有限公司網站!
    咨詢熱線

    17621170138

    當前位置:首頁 > 技術文章 > 使用點擊化學測定細胞增殖和 DNA 復制

    使用點擊化學測定細胞增殖和 DNA 復制

    更新時間:2024-03-12      點擊次數:37

    細胞增殖測定廣泛應用于細胞毒性研究、癌癥研究和細胞生物學的許多其他領域。其中許多可以通過熒光標記對增殖細胞進行可視化,并且適合高通量篩選。

    檢測復制的 DNA 可以說是檢測增殖的最直接方法。這是通過使用溴脫氧尿苷 (BrdU)核苷實現的,該核苷在復制過程中融入 DNA。然后,細胞 DNA 中的這些核苷修飾可以通過抗 BrdU 抗體檢測到。盡管具有特異性,但這種測定方法繁瑣且難以重現,因為需要用刺激性試劑處理細胞,以使 DNA 暴露于抗體,否則這些抗體不會穿透細胞結構。

    一種更溫和的替代方案是乙炔基脫氧尿苷 (EdU),可以通過將其添加到培養基中或注射到動物體內來將其遞送至細胞。摻入 DNA 后,該核苷可在銅 (I) 催化下與各種熒光染料疊氮化物結合,從而對復制的 DNA 進行熒光染色。該測定易于執行、快速且可重復。它不需要對細胞進行嚴酷的處理(只需要用 Triton 進行透化),因此可以更好地保存細胞結構。在用疊氮化染料處理和最后的洗滌步驟(步驟 8)后,可以使用具有各種發射波長的熒光團(例如 Hoechst、DAPI或熒光標記抗體)來標記細胞。

    所需試劑

    • 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷 (EdU)

    • 銅 (II)-BTTAA 絡合物— сlick сhemistry 催化劑

    • 抗壞血酸— 銅的還原劑

    • 疊氮化物熒光染料

    • DMSO,標簽級— 疊氮化物溶劑

    • Triton X-100(或 Tween-20)

    • PBS,pH 7.4

    • 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4

    協議

    確切的方案取決于特定的細胞或組織類型,但一般工作流程如下所述:

    1. 將細胞/組織與 10–20 μM EdU 孵育所需的時間。

    2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定細胞 15 分鐘。

    3. 用 PBS 清洗細胞。

    4. 用含有 0.2% Triton X-100(或 0.5% Tween-20)的 PBS 透化細胞 30 分鐘。

    5. 再次用 PBS 清洗細胞。

    6. 在 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4(對于磺化疊氮化物)或 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4(含 50% DMSO)中制備含有 2 mM 銅 (II)-BTTAA 復合物、10 mM 抗壞血酸和 5 μM 疊氮化染料的混合物(對于非磺化疊氮化物)。該混合物應新鮮制備,因為銅 (I) 在水溶液中不穩定。

    7. 將細胞與點擊反應混合物一起孵育 30 分鐘。

    8. 用 PBS 清洗細胞。

    9. (可選)如果細胞必須用不同的熒光團標記,請使用標準方案繼續染色。

    磺化(水溶性)疊氮化物,例如磺基氰疊氮化物和 AF 疊氮化物,可產生最佳效果。當使用非磺化疊氮化物(例如氰疊氮化物或 BDP 疊氮化物)時,確保反應混合物中 DMSO 濃度為 50%。


    掃一掃,關注微信
    地址:上海市嘉定區安亭鎮新源路155弄16號新源商務樓718室 傳真:Shanghai Mulong Biotechnology
    ©2024 上海牧榮生物科技有限公司 版權所有 All Rights Reserved.  備案號:滬ICP備2022017655號-1
    亚洲无码免费在线观看_亚洲色欲色欲在线大片_国产午夜成人无码免费看_免费无码AV片在线观看国产
  • <td id="iegeg"><option id="iegeg"></option></td>
  • <table id="iegeg"><option id="iegeg"></option></table>
  • <option id="iegeg"><noscript id="iegeg"></noscript></option>
    <td id="iegeg"><option id="iegeg"></option></td>