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    炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質與染料疊氮化物或炔烴的綴合

    更新時間:2024-03-12      點擊次數:50

    蛋白質標記緩沖液適用于 CuAAC 與蛋白質的反應,可保護生物分子免受活性氧的損害。該反應可用于具有炔烴或疊氮基團的蛋白質,以及用疊氮基團代謝標記的細胞或細胞裂解物的組分。

    疊氮化物與末端炔烴綴合,形成五元雜環(1,2,3-三唑)。這兩個基團(疊氮基和炔烴)在天然生物分子中都極為罕見,因此該反應具有高度特異性,可以有效地處理各種任務。

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    該反應在銅 (I) 化合物存在下進行,幾乎不依賴于 pH 值。蛋白質標記緩沖液針對蛋白質操作進行了優化,含有銅 (II) 鹽(催化活性銅 (I) 化合物的穩定前體)、醋酸三乙銨 pH 6.8、水溶性 THPTA 配體和氨基胍。建議使用新鮮配制的 抗壞血酸溶液減少銅(II)。蛋白質標記緩沖液中的 THPTA 配體通過穩定銅 (I) 的催化活性化合物來加速反應。 THPTA 配體的存在還允許在水介質(無有機溶劑)中進行蛋白質標記,并且由于銅 (I) 氧化程度的穩定,最大限度地減少活性氧 (RAS) 的產生,并防止它們通過氧化組氨酸、蛋氨酸來損壞蛋白質和半胱氨酸。蛋白質標記緩沖液中的氨基胍可防止化學反應性醛(脫氫抗壞血酸水解產物)與精氨酸、N 末端半胱氨酸和賴氨酸的側鏈結合。

    對于此反應,您將需要無疊氮鈉緩沖液中的炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質、疊氮染料或 炔烴、1.5х蛋白質標記緩沖液抗壞血酸。建議在惰性氣體(氮氣或氬氣)下執行步驟 6 至 9。

    協議

    我們推薦以下方案用于修飾蛋白質與染料衍生物的綴合:

    1. 根據要使用的修飾蛋白的量確定總反應體積:

      !炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質溶液的體積不應超過總反應體積的1/3。

      總反應體積,μL蛋白質含量
      1004至20納摩爾
      20020至40納摩爾
      40040至80納摩爾
      60080 至 600 納摩爾
    2. 使用下表計算標記反應的試劑體積:

      試劑體積,微升原液濃度
      染料疊氮化物或炔烴(蛋白質含量 [nmol])× 0.3*10 mM DMSO 或水
      蛋白質標記緩沖液(總反應體積[μL])×0.671.5倍
      活化劑(抗壞血酸)(總反應體積[μL])×0.0250 mM 水中
      (總反應體積 [μL] – 染料溶液體積 [μL] – 蛋白質標記緩沖液體積 [μL] – 活化劑溶液體積 [μL])

      * 染料過量可能會根據蛋白質分子上疊氮化物或炔基的數量而變化。表中顯示的計算結果為 3 倍過量的染料。對于 1.5–10 倍過量的染料,將蛋白質含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但請記住,如果您使用不溶于水的疊氮化物或炔烴,則過量時它可能會從反應混合物中沉淀出來。使用水溶性染料,例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

    3. 準備 染料疊氮化物或炔烴(10 mM 溶于 DMSO 或水中,適用于水溶性炔烴和疊氮化物)和活化劑(抗壞血酸,50 mM 水溶液)的儲備溶液。

      請記住,抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液 (該溶液在 1 天內穩定)。要制備儲備溶液,請將 10 mg 抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。

    4. 蛋白質標記緩沖液添加到修飾的蛋白質溶液中并渦旋。

    5. 添加計算體積的疊 氮化染料或炔烴儲備溶液,并再次渦旋均勻。

    6. (推薦)對混合物進行脫氣以除去氧氣。為此,將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管,該管連接到裝有惰性氣體(氬氣或氮氣)的氣瓶的壓力調節器。打開非常弱的氣流,放入管中,使其比液面高 3-10 毫米,避免接觸液體和管壁。氣流應在液體中形成漩渦而不濺出液體。將保持在該位置 10-20 秒。

      如果同時進行多個標記反應,可以使用離心濃縮器進行脫氣。為此,將管子放入濃縮器中,打開旋轉,打開真空 30-40 秒,然后關閉真空,同時向系統輸入端輸送惰性氣體。

    7. 添加活化劑溶液(抗壞血酸),然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關閉它。

    8. 渦旋溶液。

    9. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時。

    10. 使用透析或尺寸排阻色譜分離染料-蛋白質綴合物。


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