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    炔烴修飾的寡核苷酸與染料疊氮化物的綴合

    更新時間:2024-03-12      點擊次數:30

    點擊化學緩沖液適用于含有炔烴的寡核苷酸的合成后綴合。帶有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亞磷酰胺合成,或者您也可以在我們的網站上訂購修飾寡核苷酸的合成。

    疊氮化物與修飾寡核苷酸的末端炔綴合,形成五元雜環。這兩個基團(疊氮基和炔烴)在天然生物分子中都極為罕見,因此該反應具有高度特異性,可以有效地處理各種任務。

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    該反應在銅 (I) 存在下、中性 pH 值下進行。催化緩沖液含有銅 (II)、醋酸三乙銨 pH 7 和 DMSO。建議使用新配制的 抗壞血酸溶液來還原銅 (II)。

    對于此反應,您將需要炔烴修飾的寡核苷酸、疊氮化染料、點擊化學緩沖液抗壞血酸。您可以在我們的網站上在線訂購所有試劑。

    協議

    我們推薦以下方案用于含炔寡核苷酸與疊氮化染料的綴合:

    1. 根據要使用的寡核苷酸的量確定總反應體積:

      寡核苷酸的量總反應體積,μL
      4至20納摩爾100
      20至40納摩爾200
      40至80納摩爾400
      80 至 600 納摩爾600
    2. 使用下表計算標記反應的試劑體積:

      試劑體積,微升原液濃度
      疊氮化染料(寡核苷酸量[nmol])×0.1510 mM DMSO 溶液
      點擊化學緩沖液(總反應體積[μL])×0.671.5倍
      活化劑
      (抗壞血酸)
      (總反應體積[μL])×0.0250 mM 水中
      水(用于溶解寡核苷酸)(總反應體積 [μL] - 疊氮化染料溶液的體積 [μL] - 緩沖液的體積 [μL] - 活化劑溶液的體積 [μL])
    3. 準備疊氮化染料(DMSO 中 10 mM)和活化劑(抗壞血酸,水中 50 mM) 的儲備溶液 。

      請記住,抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液(該溶液在 1 天內穩定)。要制備儲備溶液,請將 10 mg抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。

    4. 將寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 計算體積的 水中。

    5. 添加點擊化學緩沖液和渦旋。

    6. 添加計算體積的疊 氮化染料儲備溶液并再次渦旋。

    7. (受到推崇的)。將混合物脫氣以除去氧氣。為此,將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管,該管連接到裝有惰性氣體(氬氣、氮氣或氦氣)的氣瓶的壓力調節器。打開非常弱的氣流并將頭部放入管中,使其比液位高 3-10 毫米,避免接觸液體和管壁。氣流應在液體中形成漩渦而不濺出液體。將頭部保持在該位置 10-20 秒。

      如果同時運行多個標記反應,則可以使用 SpeedVac 型系統進行脫氣。為此,將管子放入系統中,打開旋轉,打開真空 30-40 秒,然后關閉真空,同時向系統輸入端注入惰性氣體。

    8. 添加活化劑溶液(抗壞血酸),然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關閉它。

    9. 渦旋溶液。如果反應過程中形成沉淀,請將管在熱水 (70–95 °C) 中加熱,直至沉淀溶解并渦旋溶液。

    10. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時。

    11. 添加 2M 高氯酸鋰溶液(每 5 體積的反應混合物 1 體積),渦旋溶液,并添加額外的純丙酮至 2 mL。

    12. 搖動管子并使其在-20°C 下靜置 20 分鐘。

    13. 以 10,000 RPM 離心 10 分鐘,分離沉淀物。丟棄上清液。

    14. 將 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。搖動管數次,并以 10,000 RPM 離心 10 分鐘分離沉淀物。丟棄上清液。

    15. 讓沉淀物在室溫下在開口管中干燥 1 小時或將管放入 65°C 的加熱塊中 10 分鐘。

    16. 將沉淀物溶解于水中,并通過HPLC純化目標產物



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