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    使用 Pico488 進行 DNA 定量

    更新時間:2024-03-12      點擊次數:32

    Pico488 DNA 定量溶液是一種超靈敏試劑,用于在無法通過測量 260 nm 吸光度來確定雙鏈 DNA 濃度時測量雙鏈 DNA 濃度。 Pico488 選擇性地結合雙鏈 DNA,因此核苷酸、單鏈 DNA、RNA、蛋白質和其他雜質不會妨礙測量。與雙鏈 DNA 結合的染料在 503 nm 處最大吸收光并在 525 nm 處最大發射光。為了檢測測定讀數,可以使用任何類型的熒光計或熒光板讀數器。

    Pico488 測量 DNA 濃度的線性范圍為 1 pg/μL — 5 ng/μL。為了實現精確、可重復的熒光測量,我們建議在 TE 緩沖液(10 mM Tris-HCl,pH 7.5,1 mM EDTA)中稀釋 DNA 和 Pico488。為了計算 DNA 濃度,我們建議首先使用一系列 DNA 標準稀釋液建立校準曲線。

    Lumprobe 銷售各種包裝的Pico488 DNA 定量溶液和Pico488 DNA 定量試劑盒。除了 Pico488 溶液之外,該試劑盒還包括緩沖液和 DNA 標準儲備溶液。如果測定體積等于 2 ml,則試劑盒提供的染料溶液量足以分析標準熒光比色皿(體積 3.5 ml)中的 200 個實驗數據點。如果使用其他類型的設備來檢測熒光,則可以重新調整測定范圍。下表提供了常用熒光設備的推薦檢測體積。

    協議

    1. Pico488工作液的制備

    解凍 Pico488 染料瓶中的內容物,充分混合,并用緩沖液將所需量的 Pico488 染料溶液稀釋 200 倍(我們建議使用 10 mM Тris HCl、1 mM EDTA,pH 7.5)?;旌喜⒃?小時內使用。每個實驗數據點的 Pico488 工作溶液體積應等于測定體積的 50%(查看下表以查找適合您的熒光測定設備類型的推薦體積)。為所有實驗數據點(針對您計劃分析的所有樣品和所有 DNA 標準稀釋液)準備足夠的 Pico488 工作溶液。還包括額外 10-25% 的 Pico488 工作溶液體積,以排除可能的移液錯誤。要計算稀釋后的 Pico448 的體積,可以使用以下公式:

    Pico488 = 5/8 × V測定× (N 個樣品+ N 個標準品), 其中 V測定是樣品或標準品的測定體積,mL,N 個樣品 是您計劃分析的樣品數量,N 個標準品是您計劃分析的標準品數量(包括空白樣品)。

    2. 樣品溶液的制備

    在緩沖液中稀釋 DNA 樣本,使溶液體積等于測定體積的 50%(您可以使用任意量的 DNA)。添加等體積的 Pico488 工作溶液?;旌喜⒎跤?5 分鐘。同樣,制備 DNA 標準品的稀釋液。請注意,DNA 標準品的稀釋度應在樣品中 DNA 濃度的范圍內。 DNA 標準儲備液僅隨Pico488 DNA 定量試劑盒提供。Pico488 DNA 定量解決方案的用戶 應使用自己的 DNA 標準品。

    使用Pico488 DNA 定量溶液進行 DNA 定量的推薦體積

    設備類型測定體積稀釋后的 Pico488 體積稀釋 DNA 體積
    標準熒光比色皿(3.5 ml)2毫升1毫升1毫升
    其他熒光比色皿約比色皿體積的 75%比色皿體積的 37.5%比色皿體積的 37.5%
    96 孔板*,每孔0.2毫升0.1毫升0.1毫升
    24 孔板,每孔1毫升0.5毫升0.5毫升
    其他板材約占井容積的75%井體積的37.5%井體積的37.5%
    NanoDrop™ 3300*0.1毫升0.05毫升0.05毫升

    * 為了保持測量的準確性和精密度,我們建議避免移液量低于 2 µL。

    3. 熒光測量

    使用適當的吸收和發射波長或濾光片測量標準和樣品 DNA 溶液的熒光(雙鏈 DNA 結合的 Pico488 染料吸收最大波長為 503 nm 的光,發射最大波長為 525 nm 的光)。

    4. DNA濃度的計算

    繪制熒光 濃度的關系圖,并在任何軟件中應用線性回歸函數,以獲得反映熒光 ( FL ) 與濃度 ( C ) 依賴性的線性方程:
    FL = A × C + B。

    要計算稀釋樣品中的 DNA 濃度,請使用以下公式:
    C樣品= (FL樣品 — B)/A,其中FL樣品是樣品溶液熒光。

    要計算未稀釋樣品中的 DNA 濃度,請使用以下公式:
    С init = V Assay × C Sample  / V init,其中 Assay是測定體積(mL),init是初始 DNA 樣品的體積(μL)

    或者,您可以使用我們的dsDNA 定量稀釋 計算器完成所有必要的計算。

    線性回歸示例:熒光與 DNA 濃度 



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